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Liquid Chromatograph

Q HPLC에는 Normal phase(순상), Reverse phase(역상)가 있는데, 어떤 차이가 있는가 ?

A  1903년 러시아의 M. S. Tswett가 chalk(CaCO3)를 충전한 컬럼에 석유에테르를 사용하여 엽록소를 분리한

이래로 크로마토그래피는 강력한 분리분석법으로 발전을 거듭해 왔다.  이동상으로 액체를 사용하는 액체 크로마           토그래피의 경우 크게 2가지 분리모드로 나뉘어진다.

◈ Normal phase

① 컬럼 : 극성 컬럼

② 이동상 : hexane, heptane, isooctane과 같은 비극성 용액

③ 분리원리 : 시료 작용기의 극성도에 의해 분리

④ 충전물질 : SiOH, -CN, -NH2

만약 H2O와 같은 극성 물질을 사용하게 되면 시료와 충전 물질과의 강한 수소 결합으로 인                           한 tailing 현상으로 분리가 제대로 이루어지지 않으며 컬럼 수명 또한 짧아지는 단점이 있                           다.

◈ Reverse phase

① 컬럼 : silica 표면에 C18과 같은 비극성 작용기를 결합시킨 비극성 컬럼

② 이동상 : 물/아세토나이트릴이나 물/메탄올과 같은 극성 용매

③ 분리원리 : 수용액과 유기 용매 사이의 용해도 차이에 의해 분리

④ 용출순서 : 극성인 물질이 가장 빨리 나오고 비극성인 물질이 늦게 용출된다.  만일 이동상에 물의 비율                           을 높여 극성도를 증가시킨다면 비극성 시료는 컬럼에 더 오래 머무르고 늦게 나오려 하므로                           전체적인 분석시간이 길어지게 된다.

☞ 따라서 응용이 다양하고 컬럼 세척 및 재생이 용이한 Reverse phase가 점차 더 중요한 방법으로 정착하게

되었다.

Q HPLC 이동상 제조시 불순물 입자 제거 및 탈기(Degassing)를 위해 진공탈기를      하는데   이때 사용되는 여과막을 용매에 따라 어떻게 선택해야 하는가 ?

A  HPLC 사용시에는 불순물 뿐만 아니라 기포의 제거가 상당히 중요한 부분이다.

◈ 사용용매나 시료의 불순물로 인하여

① 용매에 담궈 사용하는 solvent reservoir filter가 막혀서 이동상이 펌프로 흘러가지 못할 수 있으며

② pump head내의 seal을 마모시켜서 펌프에서 용매가 새는 원인이 될 수 있고

③ check valve, filter, tubing, column 등이 막혀 시스템 압력이 높아지고 용매가 제대로 흐르지 못할 수도

있다.

◈ 기포의 유입 역시

① 압력 변화를 초래해 바탕선의 흔들림, 높은 압력으로 인한 시스템 수명 단축, 컬럼의 손상 등을 가져 올

수 있다.

이러한 원인을 제거하기 위해서 탈기를 하는 방법에는

① 진공펌프를 이용해 용액을 거르며 입자 제거 및 탈기를 동시에 하는 filtration

- Filtration을 할 경우에는 solvent clarification kit를 사용하며 이 kit의 reservoir(funnel)와 funnel     base 사이에 disk type의 membrane filter를 사용하는데 유기 용매와 수용액을 구분하여 사용하여야    한다.

유기용매가 20% 미만인 이동상, 물 100%인 이동상에는 수용성 필터를 사용하여야 한다.  수용성 필터는 PVDF(poly vinylidene fluoride) 재질로 되어 있으며 0.45㎛ pore size를 갖는 47mm ID filter를 사용하면 되고 사용 전에 100% 물을 먼저 여과하여 활성화시킨 후 사용하면 된다.

유기용매가 20% 이상인 경우에는 PTFE(poly tetrafluoro ethylene) 재질로 된 pore size 0.45㎛(Maker에 따라서 0.5㎛), ID 47mm filter를 사용하면 되고 먼저 100% 유기용매를 통과시켜 활성화시킨 후 세척을 위해 실제 사용할 이동상으로 여과하여 kit와 membrane을 세척 후 사용하면 된다.

만일 유기용매를 수용성 filter를 이용해서 filtration 하는 경우에는 membrane이 녹아서 filtration apparatus의 funnel base의 구멍을 막아 사용할 수 없게 되므로 주의하여야 한다.

Ion chromatography에 사용할 buffer는 pore size 0.22㎛의 이온 전용 필터를 이용하여 여과하여야 한다.

② 초음파를 이용하여 기포를 제거하는 Ultrasonication

③ On-line 방식으로 실험 진행동안 계속해서 용매에 용해도가 작은 He gas를 불어넣어

기포를 제거하는 방법이 있다.

Q 이동상을 새로 제조하고 탈기했음에도 불구하고 bubble이 발생한다.

어떤 문제가 있는 걸까 ?

A  이동상에 담가져 있는 Reservoir filter가 오염되어 bubble이 발생할 수 있다.

Reservoir filter는 HPLC 시스템 내에 공기 및 불순물이 유입되는 것을 방지할 목적으로 사용되며 오염된 경우           물-메탄올-6N HNO3 순으로 sonication한 후 사용합니다.

Reservoir filter는 사용 전에 메탄올 등에 담가두어 건조하지 않은 상태에서 사용합니다.

Q 미지시료 분석시 어떤 컬럼으로 분석해야 하는가 ?

A  ◈ 분자량이 2000 이상인 고분자 물질 : GPC mode를 사용

◈ 분자량 2000 이하인 시료 : 용해도 test를 해야 한다.

Hexane, Methanol, THF 순서로 녹여본다.

- Hexane에 녹는 시료 : Normal phase mode를 사용하면 된다.

즉 Silica, Porasil 컬럼을 사용하여 분석

- THF에 녹는 시료 : 지용성 GPC 컬럼인 Styragel HR column 중에서 작은 분자량에 맞는

컬럼 선택

- 메탄올 또는 메탄올/물 혼합용액에 녹는 시료 : Normal phase와 Reverse phase 모두 사용 가능

순상 컬럼 : CN, NH2 컬럼

역상 컬럼 : C18, C8, Phenyl 컬럼

- 시료가 이온성을 띠고 있는 이온 시료 : 이온 분석용 컬럼 사용

이온 컬럼 : IC-pak Anion/Cation, SAX/SCX 등

Q 컬럼 충전제의 base 물질로는 어떤 것들이 사용되는가 ?

A  Base 물질로는 inorganic ceramic이나 organic polymeric 물질이 사용된다.

inorganic ceramic에는 Silica나 Alumina가 있으며 이러한 물질은 단단하여 용매에 의해 물질이 팽창하는

swell 현상이 없다.

특히 Silica는 가장 많이 사용되는 base 물질로서 다양한 용매의 사용이 가능하며 pH 범위는 2～8 사이이다

Alumina는 Silica와 비슷하지만 수용액은 사용할 수 없다.  polymeric packing column은 inorganic packing에           비해 압력한계가 낮으며 swelling 현상으로 인해 컬럼 효율이 낮다.

A  컬럼에 충전된 물질이 같은 C18이라도 충전 물질의 표면성질에 따라 여러 가지 이름으로 불린다.

충전물질의 표면성질을 결정하는 요소에는 충전제로 사용하는 Silica의 종류, Pore Size, 표면적, 결합 상태,

Carbon Loading % 등이 있다.

◈ Particle Shape

① Irregular : 초기에 사용되던 packing 형태로서 ID 5㎛ 이상의 큰 size가 가능하며 같은 크기의 구형                            bed에 비해서 안정성이 떨어진다.

② Spherical : packing이 용이하며 컬럼의 안정성이 뛰어나고 back pressure가 적어서 컬럼수명이 길다.

5㎛ 크기를 많이 사용하나 3㎛ 크기의 bed 사용이 증가 추세에 있다.

◈ Surface Area

보통 pore size가 작으면 surface area가 크고 capacity가 높다.

◈ Pore Size

분자 크기는 분자량에 비례해서 증가하는데 분석하고자 하는 분자의 크기가 column pore size의 1/3 이상               인 경우에는 mass transport가 방해를 받아서 낮은 효율과 peak broadening 현상을 가져오므로 이 경우               에는 pore size가 큰 컬럼을 사용하여야 힌다.  보통의 분석에서는 60～130Å 사이의 pore size를 갖는               packing 물질로 된 컬럼을 사용한다.  분자량이 300 이하인 경우에는 작은 pore size를 사용하고 분자량               이 10,000보다 큰 경우에는 pore size가 300Å인 packing을 사용한다.

◈ Carbon Load

같은 ligand(C18)의 경우 loading은 surface coverage에 비례하며 ligand density(surface coverage)가 같               은 경우에는 큰 ligand(cf. C18/C1)일 경우 loading 양이 많다.

동일한 ligand, 동일한 surface coverage를 갖고 pore size가 다른 경우 carbon load는 pore size 증가               에 따라 감소한다.

ligand density가 크면 표면에 silanol의 density가 작다는 것이고 즉 가수분해에 안정하여               넓은 pH에서 사용 가능하다.

Q 컬럼의 효율에 영향을 미치는 요인에는 어떤 것이 있는가 ?

Q 기존의 C18 컬럼의 기초 이론 ?

A  컬럼의 이론단수(N)가 클수록 컬럼의 효율은 좋다.  여러 가지 요인을 살펴보면

- 유속 : 적절한 선속도 선택

- 컬럼 길이 : 길이가 길수록 N 값이 높음

- 충진물의 평균 충진 크기 : 입자 크기가 작을수록 N 값이 높음

- 충진물 크기의 분포 : 크기가 비슷한 입자들이 충진되어 있으면 N 값이 높음

- 충진물의 다공성 : pore size가 작을 경우에는 정량분석보다는 prep용으로 사용

- 주입량 : 컬럼의 dead volume(빈공간)의 1/100 이상 되는 부피 주입시 피크모양이 넓어짐

- 주입시료의 무게 : 큰 질량을 가진 시료 주입시 분리되지 않고 overlap됨

- 용매의 점도 : 점도가 높을수록 N 값이 낮아짐

- 컬럼 내경 : 내경이 작을수록 N 값이 높음

- Packing shape : 입자 모양이 구형일수록 N 값이 높음

- Extra Column effects : Guard column을 사용하지 않아야 되는 실험에 장착하면 dead volume이

커져서 N 값이 낮아짐

Q End-capping이란 무엇인가 ?

A  C18과 반응하지 않고 남아 있는 미반응의 Silanol(Si-OH)에 TMS(Trimethyl silane)을 화학 결합시켜서

비극성도를 높이는 2차 결합과정을 말한다.

대부분의 역상 컬럼에는 end-capping이 적용되는 반면 순상이나 다른 모드에 사용되는 컬럼은 end-capping을            적용시키지 않는다.  역상 모드에서도 분석에 따라 end-capping되지 않은 컬럼을 사용하여 선택성을 높이는 경           우가 있다.  그러나 아민(-NH2)과 같은 염기성 시료의 경우, end-capping이 안된 컬럼을 사용하면 다량의 미반           응 silanol(SiOH)과 수소결합이 가능하기 때문에 peak tailing이 발생하여 대칭적인 피크를 얻지 못한다.  또한           TMS는 산성조건에서 가수분해되므로 end-capping된 컬럼은 pH 2 이하에서는 사용할 수 없다.

End-capping 안된 컬럼으로는 Waters Spherisorb ODS1, Resolve C18, LiChrosorb-C18, Zorbax SB-C18이

있다.

Q 새 컬럼을 사용하고자 한다.  그냥 사용해도 되는가 ?

A  역상 컬럼의 경우, 새로 사용하려면 먼저 활성화를 시켜야 한다.

그렇지 않으면 컬럼의 안정화가 되지 않은 상태에서 분석을 하게 되어 좋지 않은 결과를 얻게 된다.

컬럼을 활성화시키기 위해서는 100% 유기용매(메탄올이나 아세토니트릴)를 유속 1mL/min으로 2시간 이상

흘려주는 것이 좋다.

Q 일반적인 컬럼 보관법은 ?

A  ◈ 순상 컬럼인  Silica Column 등

- 세척 후 hexane으로 채워서 상온 또는 냉장 보관

◈ 역상 컬럼인  C18 등

- 세척 후 60～70% 유기용매 (ACN, MeOH)로 채워서 보관

- 장기간 보관시에는 100% 유기용매로 채워서 보관

- 역상 컬럼 세척시 이동상으로 buffer를 사용한 경우에는 H2O로 충분히 세척 후 유기용매로 채워서 보관

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Q 컬럼의 수명을 늘리기 위한 방법은 ?

A  ① 컬럼이 견딜 수 있는 한계 압력을 넘지 않도록 한다.

일반적인 경우 3500psi를 넘지 않는 것이 좋으며카트리지의 경우 2000psi가 넘지 않는 것

이  좋다.(HT 컬럼은 5000psi까지)

② 이동상의 pH 범위는 2～8 사이에서 사용해야 한다.

③ 컬럼에 기기적 충격이나 진동을 피한다.

④ 이동상은 HPLC용을 사용하여야 하며 물인 경우 비저항 18㏁ 이상의 것을 사용하여야 한다.

⑤ 이동상은 반드시 filter한 후 사용한다.

⑥ 갑작스런 이동상의 조성변화 및 유속변화로 컬럼에 급격한 압력변화가 생기지 않도록 주의              한다.

Q 피크모양이 비대칭적이고 압력이 높게 걸리는 것으로 보아 컬럼이 오염된 것 같은데

어떻게 세척해야 하는가 ?

A  먼저 컬럼을 오염시킨 물질이 무엇인지 안다면 그 물질이 잘 녹는 용매로 계속 흘려주어야 한다.

컬럼이 많이 오염되었을 경우에는

- 순상컬럼의 경우 : 100% MeOH - 100% Methylene Chloride - 100% Heptane이나 Isooctane 순서로

컬럼 부피의 10배 정도씩 흘려준다.

- 역상컬럼의 경우 : 100% H2O - MeOH - Chloroform - MeOH - H2O 순서로 컬럼 부피의 10배정도

흘려준다.

컬럼 내경과 길이에 따른 컬럼 부피(mL)를 살펴보면 아래와 같다.

Column Length	Column Diameter
	3.0mm	3.9mm	4.6mm
150mm	1.060	1.791	2.49
250mm	1.766	-	4.15
300mm	-	3.582	-

컬럼을 정방향으로 세척해도 계속 압력이 높은 경우에는 컬럼을 반대로 연결하여 0.2 mL/min           유속으로 흘려주며   컬럼 inlet 부분을 세척해 준다.

심한 경우에는 컬럼 inlet 부분의 frit을 풀고 inlet filter를 ultrasonificator에서 세척하여 사용            한다.

Q Rheodyne injector를 사용하고 있다.  Injector가 오염이 된 것 같은데, 세척방법은 ?

A  Injector를 INJECT 위치에 두고 이동상이 loop의 모든 시료를 flushing 하도록 충분히 (시료            부피의 10배 이상 pumping되도록) 기다린다.  또한 Needle port cleaner에 1회용 syringe를           끼우고 이동상 1mL로 needle  port를 세척한다.

Q Rheodyne injector 사용시 leak가 발생한다.  원인과 해결방법은 ?

A  ◈ 증상 1 : 시료를 loading시키는 동안 용액이 needle port 쪽으로 새는 경우

- 점검 : ① 주입되는 마지막 3mm 쯤에서 마찰이 조금씩 증가하다가 바늘이 빡빡하게 멈출 때

② 마찰이 증가하지 않고 needle port에서 끝까지 들어가지 않으며 부드럽게 멈춰질 때

- 원인 : ① 바늘이 needle seal을 통과하고 있으나 바늘을 감싸고 있는 seal이 충분히 꽉 죄고 있지 못한

경우

② 흐르는 용액이 차서 구멍이 수축했기 때문에 바늘이 needle seal의 구멍으로 들어가지 못하고                있는 경우

- 조치 : ① 연필 끝에 붙은 지우개로 needle guide를 밀어 needle seal의 구멍을 줄여준다.

② Injector에서 rotor seal을 떼어내고 주사기 바늘로 찔러 구멍의 크기를 늘려준다.

◈ 증상 2 : needle port나 vent tube로 새다가 멈출 경우

- 원인 : vent tube가 needle port보다 높거나(needle port로 leak) 낮으면(vent tube로 leak) siphon

현상으로 인해 용액이 샌다.

- 조치 : vent tube와 needle port가 수평이 되도록 맞추어 준다.

◈ 증상 3 : needle port나 vent tube 또는 stator와 stator ring 사이에서 계속 샐 경우

- 점검 : ① 높은 유속으로 사용하거나 맞지 않는 컬럼 사용으로 시스템의 압력이 증가할 경우

(특히 4000psi 이상)

② 시스템의 압력이 안정한 때

- 원인 : ① 시스템의 압력이 sealing capability를 초과한다.

② Rotor seal이 긁혀 고압의 이동상이 샌다.

- 조치 : ① 압력조절나사를 조여주거나 set 나사를 풀어주면 stator screw를 조이는 역할로 압력을 높인다.

② Rotor seal을 교체해 준다.

Q PIC 시약은 어떤 경우에 사용하는가 ?

A  PIC 시약은 이온성 시료를 Reverse phase에서 분리하기 위해 시료에 반대 전하를 붙여 비극성화

시키는데 사용되는 변형체(modifier)입니다.

PIC 시약은 유기 역이온으로써 종래 이온성 시료에서 발생하는 분석상의 문제(Peak tailing이나 긴 분석시간)를 해결하기 위해 개발되었다.  종래의 이온 교환방법 대신 PIC 시약을 이용하면

① 정확한 pH를 조절할 필요가 없으며 재현성이 뛰어나고 컬럼의 수명도 연장된다.

② 또한 산성, 염기성, 중성 화합물을 동시에 분리할 수도 있다.

③ 이외에도 저파장용 PIC 시약은 저파장에서 사용할 때 background interference가 생기지 않으며

다음과 같은 특징을 갖는다.

- 254 nm 혹은 그 이상의 파장에서 발색단을 가지고 있지 않은 pairable 화합물에 대해서도 PIC 방법을 이       용하여 분리할 수 있으며 기존의 PIC 시약을 사용할 경우 UV response가 제한되는 화합물도 효과적으로       분리할 수 있다.

역상 크로마토그래피의 경우, 이온성이 강한 시료는 비극성 고정상에는 머무르기 어렵고 컬럼의 Vo(non-retention volume) 부근에서 용출된다.

PIC는 Paired Ion Chromatography의 첫머리로 이온성이 강한 시료의 분리, 분석을 목적으로 개발된 역상분배 크로마토그래피의 응용방법이다.

◈ 원리 : 이온성 물질의 분리, 분석에서 수용액 중에 나타나는 시료의 이온 전하에 상반하는 유기성 강전해질

대립이온을 첨가하여 ion pair extraction 현상에 의한 것으로 ion complex 형성의 결과 지용성화

되어 시료의 머무름 시간이 증가된다.

◈ 농도 : 일반적으로 1L 이동상에 PIC 시약 1병을 첨가하여 사용하며 이때 농도는 0.005M이 된다.

◈ pH : PIC-A 시약은 7.5, PIC-B 시약은 3.5로 조절되어 있다.

실험시 시료가 산성이온(－charge)이라면 이동상에 대립이온으로 염기성 이온인 PIC-A 시약을 사용하고          시료가 염기성(＋charge)이라면 첨가하는 대립이온은 산성이온인 PIC-B5 시약을 사용한다.

FD&C Sulfonic acid 염색제들(산성시료)은 이온교환방식으로 분리되는 화합물의 전형적인 예인데 PIC 시약과 역상 방식을 이용하면 Sulfonic acid 염색제와 같이 미량으로 존재하는 불순물들을 보다 쉽고 빠르게 분리할 수 있다.  일반적으로 이온교환 크로마토그래피로 분리되는 화합물 중에서 4차 amine은 PIC B 계열의 시약 중에서 하나를 이용하면 PIC 방식으로 쉽게 분리될 수 있다.  PIC D-4 시약은 물이나 물과 유기용매와의 혼합액에 첨가되면 competing base 효과에 의해 여러 종류의 amine을 분리하기에 적합하다.

형태	대립이온(Counter Ion)	UV 범위
PIC-A	tetrabutyl ammonium phosphate	240nm+
PIC D-4	dibutylamine phosphate	N/A
PIC B5	pentane sulfonic acid	240nm+
PIC B6	hexane sulfonic acid	240nm+
PIC B7	heptane sulfonic acid	240nm+
PIC B8	octane sulfonic acid	240nm+
Low UV PIC A		200nm+
Low UV PIC B5		200nm+
Low UV PIC B6		200nm+
Low UV PIC B7		200nm+
Low UV PIC B8		200nm+

PIC 방식을 이용해서 분리할 수 있는 전형적인 화합물을 아래에 정리하였다.

Compound	PIC Reagent
Alkaloids
Cephaeline	B
Emetine	B
Ergots	B
Analgesics/Antipyretics
Aspirin	A
Codeine	B
Indomethacin	A
Morphane	B
Propoxyphene	B
Antibiotics
Cephalosporins	A or B
Penicillins	A or B

Compound	PIC Reagent
Antihistamines
Chlorpheniramine	B
Diphenylhydramine	B
Methapyrilene	B
Phenindamine	B
Tripelennamine	B
Antitussives	B
B Vitamins	B-5/B-7
Calcium Leucovorin	A
Petroleum Sulfonatew	A
Folic Acid	A

Q HPLC 시스템의 압력이 갑자기 높아졌다.  컬럼의 오염이나 튜빙의 막힘은

아닌 것 같다.  이유가 무엇일까 ?

A  사용한 이동상을 제대로 여과하지 않았거나 시료 전처리가 미흡한 경우에는 컬럼이 오염될 수 있으며 튜빙이

막힐 수 있다.

또한 이동상으로 buffer를 사용한 후 물로 충분히 세척하지 않았다면 컬럼과 튜빙이 쉽게 막혀 시스템 압력이

높아질 수 있으며 pump head내의 seal 및 injector내의 seal이 쉽게 마모되어 시스템에서 용액이 새는 등 심각           한 문제를 가져올 수 있다.

그러나 이런 경우 외에도 이동상 전환이 이루어지지 않은 경우에 시스템 압력이 높아질 수 있다.  서로 섞이지            않는 이동상을 사용하게 되면 컬럼에도 심각한 영향을 미쳐 컬럼을 사용하지 못하게 될 수 있다.

이동상의 섞임성은 Misibility No.의 차이로 확인할 수 있는데 No 차이가 15이상인 경우에는 서로 섞이지 않는           다.  만일 Buffer를 사용하다가 Hexane으로 이동상을 전환하려고 한다면 중간극성의 용매 사용으로 용매의 전환           이 이루어진 후에 시스템을 사용해야 한다.  즉 Buffer - H2O - CH3CN - THF - Hexane 순으로 이동상의           전환이 이루어지도록 해야 한다.

Q 피크모양이 대칭이 아니고 leading이나 tailing 또는 split되거나 rounding된 피크        가  나타난다.  원인이 무엇일까 ?

A  컬럼이 손상된 경우일 수 있다.  세척을 해 보거나 이론단수를 측정해 보라.

또한 이동상이 현재 분석하고자 하는 물질과 맞지 않는 경우에도 위와 같은 현상이 발생할 수            있다.

이 경우에는 새로운 분석조건을 찾아보아야 한다.

Tailing 현상은 시료가 염기성 화합물인 경우에 주로 발생하며 pH를 낮게 조절하면 좀 더 대칭적인 피크를

얻을 수 있다.  시료의 주입량이 많은 경우에도 위의 현상이 발생할 수 있다.

Q 펌프의 압력이 정상보다 낮게 걸리는 경우가 있다.  어떤 이유일까 ?

A  시스템에 leak가 없는지 확인해 보라.  pump head에서 용매가 샌다면 plunger seal 또는 펌프의 sapphire

plunger가 마모되었거나 check valve가 느슨한 경우이다.

이동상이 없는 상태에서 펌프가 가동되었는지 확인해 본다.

Bubble이 있는 경우에도 시스템의 압력이 걸리지 않을 수 있다.

Q 시스템의 압력변동이 심하다. 원인은 ?

A  시스템 용매의 흐름이 일정치 않고 압력이 심하게 변하면서 바탕선이 안정되지 않는 경우는

pump head내에 bubble이 차 있거나 head에 leak 있는 경우이다.

또는 plunger나 check valve에 이상이 있을 수도 있다.

Q 컬럼에 bubble이 들어간 경우의 증상과 해결방법은 무엇인가 ?

A  컬럼에 bubble이 들어간 경우

pump에서 읽혀지는 압력이 흔들리며 크로마토그램을 찍어보면 ghost peak가 나타난다.

이때에는 column outlet 부분을 검출기와 분리시킨 후 유속 0.2 mLl/min으로 overnight시켜 bubble을

제거시킨 후에 사용한다.

검출기 signal이 흔들리는 경우에도 검출기에 bubble이 찬 경우이다.

이때에는 컬럼을 제거하고 펌프와 검출기를 union을 이용해 직접 연결한 후 5 mL/min의 높은 유속으로

흘려주어서 bubble을 제거한다.  이때 vent되는 용액이 끊어지지 않고 나오는지 본 후 bubble이 제거되었는지

확인한다.

Q UV 검출기를 사용하고 있다.  램프의 수명은 얼마나 되는가 ?

A  Deuterium lamp는 약 1000시간 가량 사용할 수 있다.

처음 기기를 사용하기 전에 230 nm에서 Reference energy를 점검해 본다.

230 nm는 최대 흡광도를 나타내는 파장으로서 사용하면서 초기 측정값과 비교해 본다.

특히 signal이 감소했다던가 baseline drift가 천천히 일어난다면 lamp energy를 check해 보아           야 한다.

Q UV 검출기의 Flow Cell을 세척하고자 한다.  어떤 방법으로 해야 하나 ?

A  ① 먼저 pump의 유속을 내리고 column을 떼어 낸다.

② pump와 detector사이를 연결하고 초순수와 섞일 수 있는 용매를 이동상으로 흘려준다.

③ 초순수로 유로의 오염물질을 세척한다.

④ 6N HNO3를 이동상으로 하여 cell을 세척한다.

⑤ 세척 후에는 다시 초순수를 흘려주어서 검출기 및 펌프에 흐르는 용액이 중성이 되도록 한다.

⑥ 다시 컬럼을 연결 한 후에 분석에 사용할 이동상으로 흘려주며 평형에 도달하도록 한다.