분

취

YMC Prep System

베너테크놀로지(주)

개

요취

ꏆ Preparative HPLC란?

시료중에 포함된 여러가지의 화학적 성분들을 크로마토그래피법으로 각각의

단일성분으로 분리시킨 후, 순수하게 다량 분취하는 장치

※ LC에 있어서 시료양의 적용한계

분 류	시료량(mg)	결과 응용
분석용 LC 소량분취용 LC 대량분취용 LC	< 1 1 - 100 > 100	Data에 의한 함량검사 구조확인, 비교 시험 표준품 사용, 물리적 시험

일반적인 분석용 HPLC와 분취용 HPLC의 기준

: 머무름 부피(VR), 용량인자(K)', 효율(H), 분리능(RS)등에 끼치는 시료의 양에 의하여 구분되며

이러한 값들이 10% 이상의 변화를 가져올 때 분취용 HPLC의 범주에 속한다고 하며 여기서

10%가 되는 지점 즉 흡착제 1g당 시료 1mg의 해당지점이며 고정상, 또는 Column의 선형용량

의 한계(Stationary Phase or Column Linear Limit)라 부른다.

cf) 분석용 LC 및 소량분취 LC : 성분의 분리시간(Speed)과 분리능(Resolution)이 먼저 고려 됨

PrepLC : 시료의 주입량, 주입농도, 그리고 Column의 용량(Ccapacity)을 우선적으로 고려.

ꏆ 분취의 목적

고순도의 물질을 최대수율로 단번에 다량얻어서

- 알려지지 않은 시료의 구조 및 특성 확인(구조 동정)

- 표준품으로 이용

- 분리, 정제 후 제품의 생산화

를 하기 위함.

개

요차취

ꏆ 기 본 원 리

고속의 용매 전달 장치를 이용하여 짧은 시간에 많은 양의 혼합시료를 이동상과 함께

컬럼내의 고정상을 통하여 흐르게 하여 고정상과 이동상에 대한 각 시료성분의 물리

화학적 성질의 차이에 의해 분리한다음, 적합한 분취 기법을 이용하여 원하는 물질을

분취한다. 일반 분석용 HPLC와 달리 분취용 Fraction Collector, 대용량 시료 주입기,

대용량 펌프, 대용량 컬럼등이 분리에 사용된다.

분 취 기 법

• Scale-Up (Heart-Cut) 기법

언제?	분취하고자 하는 단일 주 성분 이외에 적은 성분이 공존할 때	분취할 주 성분의 양이 미량일 경우
어떻게?	α값 증가 ↓ 주 성분과 기타 성분을 적절히 분리 ↓ overload ( scale up ) ↓ 다른 성분과 겹치지 않는 부분을 분취	주 성분의 peak를 scale up ↓ 주 성분의 peak 부분을 받아 냄 ↓ 농축 ↓ 왼쪽과 동일한 방법 실행
장 점	․ 일회적 ․ 대량분취가능 ․ 높은 분리능의 컬럼 사용 가능 ․ System 오염 적음 ․ Peak 확산 현상이 매우 적음 ․ Elution order가 바뀌지 않음.
단 점	용매 소비량이 Recycling 방법보다 다소 많음.

※ Scale-Up Equation

Sample Load	[eqn: RMm_p /m_a =(L_p / L_a )({r_P}^2 /{r_a}^2 )]	m : mass injected F : flow rate V : column volume SF : Scale Factor t : times in gradient table L : column length r : column radius p : preparative a : analytical
Flow Rate	[eqn: RMF_p /F_a =(L_p / L_a )({r_P}^2 /{r_a}^2 ) = V_p /V_a]
Scale Factor	[eqn: RMSF=(L_p / L_a )({r_P}^2 /{r_a}^2 )]
Gradient	[eqn: RMt_p /t_a = (V_p / V_a )({F_P} /{F_a} )]

개

요차취

• Recycle 기법

기본개념	혼합물을 컬럼에서 분리시킨후 용매와 함께 폐액으로 보내지 않고 다시 컬럼에 연속적으로 recycle 시키는 기법이다. 그러나 recycle은 약 6회 이상을 행할 경우에는 시료의 확산에 따른 분취 구간 선정이 곤란해지므로 6회 미만의 경우가 적합하다.
언 제 ?	주로, 분리가 어려운 불포화 이성질체인 cis와 trans의 합성 혼합물인 경우
어떻게?	첫째, 최적의 분리 조건을 선정 둘째, 컬럼의 내경과 길이를 파악 세째, 최대로 가능한 recycle 횟수 계산
장 점	․ 용매 소비 절감 ․ 분리능 향상
단 점	․ Peak 확산 ․ Elution order 변경 가능 ․ System 및 module 부분의 오염으로 연속작업 불가능

시료분취의 일반적 방법

1)  분석 성분의 물리․화학적 정보와 그 물질이 미량성분인지 대량성분인지 혹은

유사 성분간의 분취인지를 확인한다.

2)  1)의 정보를 토대로 분석용  HPLC에서 초기 분석 조건으로 분리하여 본다.

(순상분리법,	역상분리법, 이온교환법, 분자체 분리법중 대부분의 초기 분석 조건은

역상의 분리 방식을 많이 이용한다.)

3)  2)의 분석 결과를 검토하여 좀더 나은 분리 조건을 선택한다.

(이동상 조건, Column, 선택, 시료전처리 등을 변화시켜 α, K, N, RS 값의 증가-원하는

성분간의 피크 간격을 최대로 분리를 시도)

4)  개선된 3)의 분석 조건을 사용하여 최대 시료 Loading을 시도한다.

5)  4)의 결과를 토대로 분취조건을 결정한다.

6)  결정된 분취 조건에 따라 예비 분취를 실시한다.

8)  예비분취조건에 만족하면 예비대량분취를 한다.

(Scale-up법, Recycling법)

7)  예비 분취된 물질을 개선된 3)의 분석 조건에서 분석하여 단일 물질인지를 확인한다.

(IR, NMR, MS, PDA등을 사용하여 예비 확인을 실시 할 수도 있다.)

9)  단일 물질이 확인되면 본격적인 분취 작업을 실시 한다.

10) 분취된 물질을 수거하여 단일 물질 여부를 재확인한 후 용매를 제거하여 순수 분취물질

만 사용한다.

시총

스

템

ꏆ  분취용 HPLC의 기본적 기기 구성

				Sample
				↓
Mobile Phase	→	Solvent Delivery System	→	Injector	→	Column	→	Detector	→	Data Management sys.

**분석용 LC와 기기적 구성은 동일하나 전체적 용량은 증가

컬

럼

ꏆ YMC PrepLC Column

분석용 컬럼과의 비교

Parameter	Analytical	Preparative
Column diameter	2-5 mm i.d.	>8 mm i.d.
Column packing	10 μm totally porous or 30 μm pellicular	10 μm or 50 μm totally porous
Mobile-phase flowrate	～ 1 mL/min	>10 mL/min
Mobile-phase velocity	0.1-1 cm/sec	0.01 - 0.5 cm/sec
Sample volume	<200 μL	>1000 μL
Detector sensityvity required	High	Low
Weight of injeced sample	<0.5 mg	>100 mg

Ⅰ. Product Overviw

Ⅱ. Operating Guidelines

1. PrepLC 컬럼 운용에 적합한  System Configuration

1) Pump

• Operating limit pressure :

2) Back Pressure Considerations

• PrepLC 컬럼은 낮은 Back Pressure를 갖고 높은 유속에서  사용 가능

☞ 분취용 컬럼은 내경이 크고, 충진물의 particle size가 크기 때문

• Pressure vs 컬럼길이

: Particle Size ≥ 15um 이상

- 컬럼 길이가 증가하여도 유속 증가에 따른 압력 영향을 받지 않음.

: Particle Size ≤ 10um 이하

- 컬럼 길이에 따라 영향을 받음.

컬

럼

• 이동상의 점도

- 위에서 압력 측정에 사용된 용매의 점도 : 1 centipoise

- 이동상의 점도를 아는 것은 압력을 예측할 수 있게 한다.

ex. 이동상을 2cp 점도의 methanol/water를 사용할 경우, 그 압력은

1cp를 갖는 이동상을 사용했을 때의 두배가 된다.

3) Detectors

• 대부분의 Waters 검출기는 option으로 prep cell을 가지고 있다.

• 보통 튜빙의 내경은 보통 0.04 inch 이다.

•  분취 응용시 Flow splitter를 권장한다.

4) Injectors

•  preparative manual injector가 공급.

• 다른 시스템 구성에 공급되어야 할 injector라면,

7725의 sample loop 범위가 1uL에서 5mL까지 필요.

• 또 더 많은 주입량이 요구되면,

다른 분취용 Rheodyne injector 제공.

5) Tubing

•시스템 구성할 때, backpressure를 일으키지 않도록 tubing을 선택.

•40mm ID 칼럼을 사용할 때, 모든 tubing은 0.03inch 이상이어야 한다.

6) Particle Size Selection

• Van Deemter Plots(그림 )

- 작은 입자의 분취용 충진물의 경우, 최적유속: 30-50ml/min

- 유속이 증가함에 따라 효율이 감소되지 않았다.

컬

럼

2. Basic of Prep Scale-Up

먼저 <4mm 또는< 8mm ID의 작은 칼럼상에서 분리를 최적화하고 시료량을 최대화 하는

것이 바람직하다. 이때 얻어지는 정보는 바람직한 분취와 회수를 위해 분취에 요구되는

컬럼 크기를 결정하는데 사용되어질 수 있을 뿐만 아니라 컬럼에 load할 수 있는 시료의

양을 결정하는데에도 사용되어질 수 있다.

1) General Column Capacity Chart

Column Segment Dimension	Typical Loads	Typical Flow Rates
>8mm × 100 mm	ug - 25mg	0.5 - 2.0 ml/min
>25mm × 100 mm	25 mg - 250 mg	5 - 40 ml/min
> 40mm × 100 mm	250 mg - g	40 - 150 ml/min

2) What Are the Important  Factors in Preparative Separation?

분취에 있어서 중요한 인자는 분석용 HPLC에서와 같이 이론 단수(N), 용량 인자(k'),

분리인자(α) 모두 분리능(resolution)에 영향을 준다. 충진물의 particle size와 컬럼

길이는 칼럼 효율(H)과 분리 속도(speed)에 영향을 준다.

이들 인자들 중에 어떤 하나의 인자를 바꾸어주는 것은 분리 전체에 영향을

미칠 수 있다. 즉, 한가지 인자를 바꾸는 것은 전체 분취 전략에 중요하다.

• Altering Selectivity(α) to Improve Column Load and Speed

α(분석물과 그 근처에 있는 피크사이의 분리)의 향상은 product purity에 영향을

끼치지 않고 높은 시료 주입량을 가능하게 한다. 특히 α값이 작을 때는 α의 작은

증가도 현격하게 속도와 처리량을 증가시킬 수 있다. 이러한 α의 변화를 위해 종종

이동상의 변화를 주어 바꾸어 준다. 그러나 포화 상태의 이동상의 성질을 바꾸는 것

또한 중요한 역할을 한다.

컬

럼

3) HOW DO YOU SCALE-UP A SEPARATION

• Select a Scaling Column

분리의 복합/복잡성 때문에 충진물의 화학적 성질과 입자 크기가 최상의 분리능과

선택성을 제공하도록 분취용 컬럼을 선택한다.  대게 scale-up 하기 전에 내경이

3.9mm or 8mm의 컬럼으로  분리를 진행하여 크로마토그래픽 조건을 최적화한다.

그 다음에 column load, flow rate, gradient condition을 scale-up한다.

중요한 것은 scale-up한 분취용 칼럼의 충진물은 기초 작업으로서 진행한

분리에서의  충진물질과 같은것을 사용하여야 한다는 것이다.

• Conduct a Loading Study

일단 분리 조건이 최적화되면, 분석 컬럼에서의 시료 주입량이 최상의 분리능과 순도를

갖게 하면서 최대량을 주입할 수 있도록 증가 시킨다.

• Scale-up of the Sample Load and Flow Rate

분석 조건이 최적화 되면, 같은 충진물을 담고 있는 분취용 컬럼이 선택되어져서 더 많은 물질을 분취하도록 한다.

컬

럼

※ Scale-Up Equation

Sample Load	[eqn: RMm_p /m_a =(L_p / L_a )({r_P}^2 /{r_a}^2 )]	m : mass injected F : flow rate V : column volume SF : Scale Factor t : times in gradient table L : column length r : column radius p : preparative a : analytical
Flow Rate	[eqn: RMF_p /F_a =(L_p / L_a )({r_P}^2 /{r_a}^2 ) = V_p /V_a]
Scale Factor	[eqn: RMSF=(L_p / L_a )({r_P}^2 /{r_a}^2 )]
Gradient	[eqn: RMt_p /t_a = (V_p / V_a )({F_P} /{F_a} )]

Scale-Up Strategy Summary

1. Define the problem

2. Develop and optimize the separation on an analytical

size column with preparative packings

3. Maximize throughput

4. Increase sample mass and volume to the maximum

while meeting purity objectives

5. Determine recovery

6. Scale up to desired column size to meet

thoughput/load objectives

7. Pool fractions of comparable purity

and rerun if necessary

8. Check fraction purity using analytical column

응

용

ꏆ 응용 분야

▶ 응용 Field

- 천연유기물질	- 천연유기약리성분

- 합성유기물질	- 합성의약품

- 단백질	- Peptide

- 고분자물질	- 고분자 첨가제

생체내 활성단백질, 세포배양액 추출물 등의 생물학적 주요 구성성분 또는 지용성 고분자

합성에 사용되는 첨가제 등의 분취에 사용되며, 위와 같이 식품, 제약, 정밀화학, 의학,

보건환경, 고분자 분야 등 그 응용분야가 매우 다양하다.

▶ 응용기관

- 국‧공립연구기관

- 민간업체연구기관

- 대학 및 대학부설연구기관

시

장

성

ꏆ Target Customer

- 제약(Pharmcologists)

- 천연물 연구기관(Natural Product Chemists)

- 생명공학 연구기관(Peptide Chemists/ Synthetic Organic Chemists)

- 관련 대학 및 대학부설 연구기관(Researcher)

ꏆ 고객의 요구/고려 사항

- 목적의 부합성 : 분리능이 뛰어난가?

: 그래서, 얻고자 하는 분석 성분을 순수하게 다량 분취할 수 있을까?

- 편리성        : 쉽게 분취할 수 있을까?

- 응용 지원     :

- 경제성/가격

ꏆ Promotion Point

- 분석영역에서 분취영역까지 단일 시스템으로 쉽게 접근

- 경제적

- 분리능에 영향을 주는 최적의 컬럼 제공과 더불어

- 그러한 컬럼을 수용할 수 있는 시스템 제공

** 분취 목적에 맞는 Pure한 물질을 다량 얻을 수 있다.

- 빠른 분석 방법 개발과 손쉬운 분취를 할수 있도록 specialist 지원

** 시행착오를 줄이고 노동력 및 시간을 절약할 수 있다.

요컬

약럼

ꏆ 요   약

대량 분취를 성공적으로 수행하기 위해서는 먼저 시료의 분취량을 사전에 결정해야 하고

기기적으로 Pump, Injector, Column, Detector 등이 적합한 장치를 선택할 필요가  있다.

실제로 분취과정은 사전에 충분히 시료를 clean-up 시켜야 한다.

Clean-up된 시료는 HPLC에 의하여 최적 분리조건 즉 최적의 값, 최적의  pump의 유량 및

용매의 선택을 해야 한다.

분취의 기술로는 scale-up법, shave-recycle법, gradient 법 등을 이용하며, 용매와 함께 분취된 시료는

물리적 화학적 성질을 이용하여 정제를 시킬 수 있다.  항상 정제된 시료는 불순물의 유무를

HPLC나 TLC에 의하여 확인해야 하고 필요하다면 다시 Prep-LC를 이용하여 재분리하여 분취할

필요가 있다. 99%-α 이상의 순도로 많은 양을 요구하려면 시료의 양과 분리능 분리속도 등은

실험자가 항상 염두에 두어야 한다.

이러한 것들에 맞추어 현재 Waters,YMC사에서는 분취에 가장 적합한 system을 제공하고 있을 뿐만

아니라 많은 Konw-how를 가지고 있는 숙련된 응용지원으로, 보다 폭넓은 범위에 있어

User 및 Customer 분들에게 가치있는 system으로 자리 잡고 있다.